Μιχαήλ Ματαλλιωτάκης, Ιωάννης Καλογιαννίδης Γ’ Μαιευτική Γυναικολογική Κλινική, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης
Summary
Molecular karyotyping is an effective, modern prenatal tool that offers superior resolution than conventional karyotyping, detecting small chromosomal microdeletions and duplications missed by standard methods. It detects abnormalities in approximately 10% of cases where conventional karyotyping is normal. It is performed through amniocentesis or chorionic villus sampling, or even peripheral blood sampling from the parents, if it is necessary. It is particularly recommended when there are abnormal fetal ultrasound findings and/or a history of abnormal individual or family history. The key advantages of molecular karyotyping are its greater diagnostic capability, faster results, smaller sample size, and simpler laboratory protocol. Precise genetic counseling by specialized professionals, before and after, helps understand and accept the results, especially in the case of variants of uncertain significance. The clinical severity of a condition becomes complex due to phenotypic heterogeneity, which contributes to the possibility of ethical problems, since the same variants may be associated with a child’s predisposition to develop a severe or milder disease. The purpose of our study is to review the current literature regarding molecular karyotyping as a major diagnostic test for pregnancies.
ΠΕΡΙΛΗΨΗ
Ο μοριακός καρυότυπος αποτελεί την πιο σύγχρονη μέθοδο προγεννητικού ελέγχου για την ανίχνευση γενετικών διαταραχών. Έχει μεγάλη διακριτική ικανότητα και ανιχνεύειμικροελλείψεις και μικροδιπλασιασμούς, γενετικές αλλαγές στην ποσότητα του DNA που δεν είναι ορατές με τον συμβατικό έλεγχο. Στον προγεννητικό έλεγχο διαγιγνώσκει ανωμαλίες σε ποσοστό έως και 10% των περιπτώσεων όπου ο συμβατικός καρυότυπος είναι φυσιολογικός. Πραγματοποιείται μέσω αμνιοπαρακέντησης ή λήψης χοριακών λαχνών ή και τη λήψη περιφερικού αίματος από τους γονείς, όταν κριθεί απαραίτητο. Συνιστάται ιδιαίτερα όταν υπάρχουν παθολογικά υπερηχογραφικά ευρήματα ή/ και η παρουσία παθολογικού ατομικού ή οικογενειακού ιστορικού. Μεταξύ των πλεονεκτημάτων του είναι η μεγαλύτερή διαγνωστική του ικανότητα, η έκδοση αποτελέσματος σε συντομότερο χρονικό διάστημα, η μικρότερη ποσότητα δείγματος αλλά και το πιο απλό εργαστηριακό πρωτόκολλο που απαιτείται. Η καλή συμβουλευτική από εξειδικευμένους επαγγελματίες, πριν και μετά βοηθάει στην κατανόηση και αποδοχή του αποτελέσματος, ιδιαίτερα στην περίπτωση πολυμορφισμών άγνωστης προς το παρόν κλινικής σημασίας. Η κλινική σοβαρότητα μιας κατάστασης καθίσταται πολύπλοκη, λόγω της φαινοτυπικής ετερογένειας που συντελεί στην πιθανότητα εμφάνισης ηθικών προβλημάτων, αφού οι ίδιες παραλλαγές μπορεί να σχετίζονται με την προδιάθεση το παιδί να αναπτύξει σοβαρή ή ήπια νόσο. Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η ανασκόπηση της σύγχρονης βιβλιογραφίας σχετικά με τη χρήση του μοριακού καρυότυπου ως μέθοδο διάγνωσης στην προγεννητική περίοδο.
Εισαγωγή
Την τελευταία δεκαετία ο μοριακός καρυότυπος αποτελεί εξέταση µε μεγάλη ευαισθησία και ακρίβεια στη µελέτη των χρωµοσωµατικών ανωµαλιών, αντικαθιστώντας τη κλασσική κυτταρογενετική ανάλυση. Η ενσωμάτωση του στην προγεννητική διάγνωση προήλθε μετά τη συσχέτισή του με διάφορες παιδικές παθήσεις και νευροαναπτυξιακές διαταραχές, οι οποίες οφείλονται σε μικρά ελλείμματα και διπλασιασμούς (Copy Number Variants-CNVs), που παραμένουν αδιάγνωστα με τη χρήση του συμβατικού καρυοτύπου. Στον προγεννητικό έλεγχο, ο μοριακός καρυότυπος διαγιγνώσκει ανωμαλίες σε ποσοστό έως και 10% των περιπτώσεων όπου ο συμβατικός καρυότυπος είναι φυσιολογικός. Με αναλυτική και ανιχνευτική ικανότητα έως και 1.000 φορές μεγαλύτερη, παρέχει τη δυνατότητα ανίχνευσης μη ισοζυγισμένων χρωμοσωμικών αναδιατάξεων (ελλειµµάτων και διπλασιασµών) σε όλο το γονιδίωµα του ανθρώπου. Ο συµβατικός καρυότυπος ανιχνεύει ορατές βλάβες στο μικροσκόπιο, αντιθέτως, ο μοριακός καρυότυπος ανιχνεύει παραλλαγές ακόμη και σε μερικά εκατοντάδες ζεύγη βάσεων, δίνοντας τη δυνατότητα να εντοπίσουμε παραλλαγές που συνδέονται με σοβαρές κλινικές εκδηλώσεις. Αποτελεί μια ποσοτική μέθοδο που ανιχνεύει παθολογικές και φυσιολογικές πολυμορφικές αλλαγές. Οι παραλλαγές που προκύπτουν εκ νέου στον οργανισμό (de novo) σχετίζονται με αυξημένο κίνδυνο (6-8 %) εμφάνισης κλινικών συμπτωμάτων. Ενώ οι παραλλαγές που είναι κληρονομικές σχετίζονται με μειωμένο κίνδυνο (<1%).
Σύνδρομο Di George (22q11.2 διαγραφή)
Ο μοριακός καρυότυπος αποτελεί το κορυφαίο παράδειγμα για τη διάγνωση του συνδρόμου DiGeorge, το πιο συχνό μικροελλειπτικό σύνδρομο. Το σύνδρομο εμφανίζεται σε περίπου 1 στις 2.000 έως στις 4.000 γεννήσεις και αποτελεί το 2ο πιο συχνό γενετικό σύνδρομο μετά το σύνδρομο Down, ανεξαρτήτου ηλικίας της μητέρας. Έχει ποικίλη διεισδυτικότητα και εκφραστικότητα και μπορεί να κληρονομηθεί με αυτοσωμικό επικρατή χαρακτήρα ή de Novo (90% των περιπτώσεων).
Κλασσικές τεχνικές μοριακού καρυοτύπου
Οι κλινικοί ιατροί θα πρέπει να γνωρίζουν ότι υπάρχουν δυο γενικές κατηγορίες τεχνικών μοριακού καρυότυπου, η τεχνική των μικροσυστοιχειων και τεχνική των σημειακών πολυμορφισμών, που προτιμώνται στις μονογονεϊκές δισωμίες (Prader-Willi, Angelman), στις ισοζυγισμένες μεταθέσεις, στις τριπλοειδίες και στη διενέργεια του Test πατρότητας.
Οι Hillman SC και οι συνεργάτες, σε μια συστηματική ανασκόπηση της βιβλιογραφίας και μετα-ανάλυση παρατήρησαν ότι η διαγνωστική αξία του μοριακού καρυτοτύπου σε έμβρυα με ανατομικές υπερηχογραφικές ανωμαλίες προσθέτει ένα 7% στην ανίχνευση παθολογίας. Περαιτέρω, οι Martinez-Portilla RJ και οι συνεργάτες, παρατήρησαν ότι ο μοριακός καρυότυπος προτιμάται στον ενδομήτριο θάνατο, στη βιοψία νεκρού υλικού, ειδικά στο πρώτο τρίμηνο, αφού η αποτυχία του περιορίζεται στο 10%.
Ενδείξεις εφαρμογής
Κατά την προγεννητική διάγνωση, ο μοριακός καρυότυπος εφαρμόζεται σε δείγματα DNA που απομονώνονται από τις χοριακές λάχνες, το αμνιακό υγρό ή και το περιφερικό αίμα των γονιών, όταν κριθεί απαραίτητο. Ενδείξεις για την διενέργεια του αποτελούν η παρουσία εμβρυικών ανωμαλιών στο υπερηχογράφημα, η παθολογική αυχενική διαφάνεια, το προηγούμενο μαιευτικό ή και οικογενειακό ιστορικό (γενετική διαταραχή, καθ’ έξιν αποβολές, παρουσία χρωμοσωμικής ανωμαλίας). Σε όλες τις ενδείξεις προγεννητικής εξωμικής ανάλυσης (Prenatal Exome Sequencing, PES) που ακολουθούν, απαραίτητη προϋπόθεση αποτελεί η προηγούμενη ή ταυτόχρονη εφαρμογή μοριακού καρυοτύπου.
Πλεονεκτήματα και περιορισμοί
Μεταξύ των πλεονεκτημάτων του είναι η μεγαλύτερή διαγνωστική του ικανότητα, η έκδοση αποτελέσματος σε συντομότερο χρονικό διάστημα, η μικρότερη ποσότητα δείγματος αλλά και το πιο απλό εργαστηριακό πρωτόκολλο που απαιτείται. Περιορισµοί αποτελούν η αδυναμία ανίχνευσης ισοζυγισμένων μετατοπίσεων, η πιθανότητα μη ανίχνευσης χαμηλού επιπέδου μωσαϊκισμού, η έλλειψη πληροφοριών σχετικά με τον μηχανισμό δημιουργίας της παραλλαγής, καθώς και η αδυναμία ανίχνευσης σημειακών μεταλλάξεων. Ένα αρνητικό αποτέλεσμα δεν αποκλείει ότι ένας παθολογικός φαινότυπος μπορεί να οφείλεται σε μεμονωμένες μεταλλάξεις, ευρήματα μικρού μεγέθους καθώς και σε άλλες γενετικές διαταραχές.
Κλινική Σημασία των Παραλλαγών Αριθμού Αντιγράφων
Όσον αφορά τη κλινική σημαντικότητα, οι παραλλαγές εμφανίζουν μεγάλη διακύμανση, η οποία ταξινομείται σύμφωνα με τη κλασσική κατηγοριοποίηση. Η κατηγορία άγνωστης αιτιολογίας (Variant of Uncertain Significance, VUS) αφορά παραλλαγές που δεν έχουν καταγραφεί προηγουμένως στη διεθνή βιβλιογραφία και τις βάσεις δεδομένων. Σε αυτές τις περιπτώσεις θα πρέπει να γίνεται συσχέτιση μεταγεννητικά του φαινοτύπου με την παραλλαγή.
Φαινοτυπική ετερογένεια- ερμηνεία παθολογικού αποτελέσματος
Στις περισσότερες περιπτώσεις το αποτέλεσμα θα είναι σαφές, όμως σε ένα μικρό ποσοστό δεν θα είναι, και αυτό οφείλεται στην φαινοτυπική ετερογένεια (λόγω της μεταβαλλόμενης διεισδυτικότητας και εκφραστικότητας), όπου η κλινική σοβαρότητα μιας κατάστασης καθίσταται πολύπλοκη. Ενδέχεται η ίδια χρωµοσωµατική ανωµαλία να µην προκαλεί πρόβλημα στον γονέα, αλλά σοβαρά προβλήματα στο έµβρυο. Οι παραλλαγές που συνδέονται με διαταραχές όψιμης έναρξης στην παιδική ηλικία και για τις οποίες υπάρχουν διαθέσιμες προληπτικές ή θεραπευτικές επιλογές θα πρέπει να γνωστοποιούνται. Αντίθετα, ασθένειες χωρίς θεραπευτικές δυνατότητες (νόσος Αλτσχάιμερ), κοινοποιούνται μετά από γενετική και ψυχολογική συμβουλευτική, στο πλαίσιο βεβαρημένου οικογενειακού ιστορικού. Η αναγνώριση ενός θήλεος εμβρύου (ή της μητέρας) ως φορέα μιας φυλοσύνδετης διαταραχής είναι ωφέλιμο να γνωστοποιείται. Η καλή συμβουλευτική από εξειδικευμένους κλινικούς- εργαστηριακούς γενετιστές, εμβρυομητρικούς και παιδιάτρους, πριν και μετά βοηθάει στην κατανόηση και αποδοχή του αποτελέσματος. H ένταξη σε ομάδες υποστήριξης, καθώς και σε άλλες οικογένειες με παιδί που έχει την ίδια πάθηση, είναι χρήσιμη για να βοηθήσουν την έγκυο να κατανοήσει τη διάγνωση και να λάβει απόφαση σχετικά με την εγκυμοσύνη. Οι γονείς πρέπει να γνωρίζουν ότι η συμβουλευτική βασίζεται στην υπάρχουσα γνώση η οποία συνεχώς ανανεώνεται και καταγράφεται στη βάση δεδομένων OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man). Σε προγεννητικό επίπεδο, οι ηθικές προεκτάσεις για την εμφάνιση μιας ασθένειας, αποτελούν ένα περίπλοκο πεδίο, αφού οι ίδιες παραλλαγές μπορεί να σχετίζονται με την προδιάθεση το παιδί να αναπτύξει σοβαρό αυτισμό ή πιο καλοήθεις μαθησιακές διαταραχές. Όπως επίσης, άτομα με σύνδρομο Di George μπορεί να αναπτύξουν μείζονες ή άλλες πιο ήπιες μορφές ψυχικής ασθένειας στην ενήλικο ζωή.
Βιβλιογραφία
1. Wapner RJ, Martin CL, Levy B, Ballif BC, Eng CM, Zachary JM, Savage M, Platt LD, Saltzman D, Grobman WA, Klugman S, Scholl T, Simpson JL, McCall K, Aggarwal VS, Bunke B, Nahum O, Patel A, Lamb AN, Thom EA, Beaudet AL, Ledbetter DH, Shaffer LG, Jackson L. Chromosomal microarray versus karyotyping for prenatal diagnosis. N Engl J Med. 2012 Dec 6;367(23):2175-84.
2.Callaway JL, Shaffer LG, Chitty LS, Rosenfeld JA, Crolla JA. The clinical utility of microarray technologies applied to prenatal cytogenetics in the presence of a normal conventional karyotype: a review of the literature. Prenat Diagn. 2013 Dec;33(12):1119-23.
3.Hillman SC, McMullan DJ, Hall G, Togneri FS, James N, Maher EJ, Meller CH, Williams D, Wapner RJ, Maher ER, Kilby MD. Use of prenatal chromosomal microarray: prospective cohort study and systematic review and meta-analysis. Ultrasound Obstet Gynecol. 2013 Jun;41(6):610-20.
4. Vanakker O, Vilain C, Janssens K, Van der Aa N, Smits G, Bandelier C, Blaumeiser B, Bulk S, Caberg JH, De Leener A, De Rademaeker M, de Ravel T, Desir J, Destree A, Dheedene A, Gaillez S, Grisart B, Hellin AC, Janssens S, Keymolen K, Menten B, Pichon B, Ravoet M, Revencu N, Rombout S, Staessens C, Van Den Bogaert A, Van Den Bogaert K, Vermeesch JR, Kooy F, Sznajer Y, Devriendt K. Implementation of genomic arrays in prenatal diagnosis: the Belgian approach to meet the challenges. Eur J Med Genet. 2014 Mar;57(4):151-6.
5.Practice Bulletin No. 163: Screening for Fetal Aneuploidy. Obstet Gynecol. 2016 May;127(5):e123-e137.
6.Shah MS, Cinnioglu C, Maisenbacher M, Comstock I, Kort J, Lathi RB. Comparison of cytogenetics and molecular karyotyping for chromosome testing of miscarriage specimens. Fertil Steril. 2017 Apr;107(4):1028-1033.
7.Nowakowska, B. Clinical interpretation of copy number variants in the human genome. J Appl Genet 58, 449-457, (2017).
8.Levy B, Wapner R. Prenatal diagnosis by chromosomal microarray analysis. Fertil Steril. 2018 Feb;109(2):201-212.
9.Stosic M, Levy B, Wapner R. The Use of Chromosomal Microarray Analysis in Prenatal Diagnosis. Obstet Gynecol Clin North Am. 2018 Mar;45(1):55-68.
10.Martinez-Portilla RJ, Pauta M, Hawkins-Villarreal A, Rial-Crestelo M, Paz Y Miño F, Madrigal I, Figueras F, Borrell A. Added value of chromosomal microarray analysis over conventional karyotyping in stillbirth work-up: systematic review and meta-analysis. Ultrasound Obstet Gynecol. 2019 May;53(5):590-597.
11.Cortés-Martín J, Peñuela NL, Sánchez-García JC, Montiel-Troya M, Díaz-Rodríguez L, Rodríguez-Blanque R. Deletion Syndrome 22q11.2: A Systematic Review. Children (Basel). 2022 Aug 3;9(8):1168.
12. Βούλα Βελισσαρίου, Aθηνά Βέρβερη, Ασπασία Διβανέ, Αναστασία Κωνσταντινίδου, Γιώργος Μακρυδήμας, Περικλής Μακρυθανάσης, Ανδρέας Πάμπανος, Ιωάννης Παπουλίδης, Σταύρος Σηφάκης (συντονιστής), Χρισταλένα Σοφοκλέους, Αλέξανδρος Σωτηριάδης, Μαρία Τζέτη, Ιωάννα Traeger-Συνοδινού, Λίνα Φλωρεντίν, Ελένη Φρυσίρα. ΚΑΤΕΥΘΥΝΤΗΡΙΕΣ ΟΔΗΓΙΕΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΤΗΣ ΑΛΛΗΛΟΥΧΗΣΗΣ ΝΕΑΣ ΓΕΝΙΑΣ (NGS/WES) ΣΤΟΝ ΠΡΟΓΕΝΝΗΤΙΚΟ ΕΛΕΓΧΟ. Ελληνική Εταιρεία Περιγεννητικής Ιατρικής Μάρτιος 2024